Часто задаваемые вопросы о наборе для выделения тотальной РНК животных/клеток

Следующий анализ проблем, с которыми вы можете столкнуться при экстракции РНК из тканей/клеток животных, поможет вам в ваших экспериментах.Кроме того, для других экспериментальных или технических проблем в дополнение к инструкциям по эксплуатации и анализу проблем у нас есть специальная служба технической поддержки, чтобы помочь вам.Если у вас есть какие-либо потребности, свяжитесь с нами по телефону: 028-83360257 или по электронной почте: Tech@foregene.com.

РНК не экстрагируется или выход РНК низкий

Часто существует множество факторов, влияющих на эффективность извлечения, например: содержание РНК в образце ткани, метод операции, объем элюции и т. д.

1. Во время работы проводили ледяную баню или криогенное (4 °C) центрифугирование.

Рекомендация: Работать при комнатной температуре (15-25°С) на протяжении всего процесса, не использовать ледяную баню и центрифугировать при низких температурах.

2. Неправильное хранение проб или чрезмерное время хранения проб.

Рекомендация: Храните образцы при температуре -80 °C или замораживайте в жидком азоте и избегайте многократного замораживания-оттаивания;попробуйте использовать свежие ткани или культивированные клетки для выделения РНК.

3. Недостаточный лизис образца.

Рекомендация: при гомогенизации ткани убедитесь, что ткань достаточно гомогенизирована и что клетки ткани достаточно расщеплены, чтобы объяснить высвобождение РНК.

4. Неправильно добавлен элюент.

Рекомендация: Убедитесь, что ddH2O, не содержащая РНКаз, добавляется по каплям в середину мембраны очистительной колонки.

5. В буфер RL2 или буфер RW2 был добавлен неправильный объем абсолютного этанола.

Рекомендация: Следуйте инструкциям, добавьте правильный объем абсолютного этанола в буфер RL2 и буфер RW2 и хорошо перемешайте перед использованием набора.

6. Неправильная дозировка образца ткани.

Рекомендация: используйте 10–20 мг ткани или (1–5) × 106 клеток на 500 мкл буфера RL1, поскольку чрезмерное использование ткани может привести к снижению выделения РНК.

7. Неправильный объем элюции или неполная элюция.

Рекомендация: объем элюции очистительной колонки 50-200 мкл;если эффект элюирования неудовлетворителен, рекомендуется увеличить время помещения при комнатной температуре после добавления предварительно нагретой ddH2O, не содержащей РНКаз, например, на 5-10 мин.

8. После промывки буфером RW2 в очистной колонке остается этанол.

Рекомендация: при наличии остатка этанола после промывки буфером RW2 центрифугирование пустой пробирки в течение 1 мин, время операции центрифугирования пустой пробирки может быть увеличено до 2 мин, или колонка для очистки может быть помещена при комнатной температуре на 5 мин для адекватного удаления остатка. этиловый спирт.

Очищенная РНК деградирует

Качество очищенной РНК зависит от таких факторов, как сохранность образца, загрязнение РНКазой, манипуляции и т. д.

1. Образцы тканей не хранятся вовремя.

Рекомендация: Если образцы ткани или клетки не используются своевременно после сбора, немедленно заморозьте их при температуре -80 °C или в жидком азоте.Для выделения РНК по возможности используйте только что взятый образец ткани или клетки.

2. Повторное замораживание-оттаивание образцов тканей.

Рекомендация: при хранении образцов тканей лучше всего разрезать их на мелкие кусочки для сохранения и удалять один из кусочков при использовании, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания образца и деградации РНК.

3. РНКаза введена или без одноразовых перчаток, масок и т.п. во время операции.

Рекомендация: эксперименты по извлечению РНК лучше всего проводить в отдельных комнатах для манипуляций с РНК, а стол убирается перед экспериментом.

Носите одноразовые перчатки и маски во время эксперимента, чтобы свести к минимуму деградацию РНК, вызванную введением РНКазы.

4. Реагенты загрязнены РНКазой во время использования.

Рекомендация: заменить на новый набор для выделения тотальной РНК животных для связанных экспериментов.

5. Центрифужные пробирки, наконечники и т. д., используемые для манипуляций с РНК, загрязнены РНКазой.

Рекомендация: Убедитесь, что центрифужные пробирки, наконечники, пипетки и т. д., используемые для выделения РНК, не содержат РНКазы.

Очищенная полученная РНК влияет на дальнейшие эксперименты

РНК, очищенная на очистительной колонке, если ионы соли, содержание белка слишком велико, повлияет на последующие эксперименты, такие как: обратная транскрипция, северный блот и др.

1. Элюированная РНК содержит остатки солевых ионов.

Рекомендация: Убедитесь, что в буфер RW2 добавлен правильный объем этанола, и выполните 2 промывки колонок очистки при скорости центрифугирования, указанной для работы;если есть какой-либо остаток солевого иона, оставьте очистительную колонку в буфере RW2 на 5 минут при комнатной температуре и проведите центрифугирование, чтобы максимально удалить солевое загрязнение.

2. Остаток этанола в элюированной РНК.

Рекомендация: Подтвердите, что после промывки буфером RW2 выполните операцию центрифугирования пустой пробирки на скорости центрифугирования, указанной для работы, увеличьте время операции центрифугирования пустой пробирки до 2 минут, если все еще есть остатки этанола, или оставьте ее при комнатной температуре на 5 мин после центрифугирования пустой пробирки для максимального удаления остатков этанола.