Подготовка и меры предосторожности извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Стерилизация подсказок пипетки и трубок EP, etc.

1. Подготовьте 0,1% (одних тысячное) DEPC (сильно ядовитое вещество) с деионизированной водой, используйте его осторожно в клобуке перегара, и сохраните оно на 4°C далеко от света;

Вода DEPC чистая вода обработанная с DEPC и простерилизованная высокой температурой и высоким давлением. Испытанный для того чтобы быть свободна рНКазы, DNase и протеиназы.

2. Положите подсказку пипетки и трубку EP в 0,1% DEPC, и обеспечьте что подсказка пипетки и трубка EP заполнены с 0,1% DEP.

3. Защитите от светлого, позвольте стойке, всю ночь (12-24h)

4. Коробке содержа подсказку и трубку EP не нужно быть выдержанным в DEPC. После грубо извлекать воду DEPC в подсказке или трубке EP, упакуйте ее вверх и создайте программу-оболочку она вверх.

5. 121 градус цельсия, 30min

6. 180 градус цельсий, сушат на несколько часов (по крайней мере 3 часа)

Примечание: A. перчатки и маски латекса носки при регуляции DEPC! b, или без стерилизации DEPC, 130 ℃, автоклав 90min (стерилизация много лабораторий высокотемпературная дважды)

Рассмотрение извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

2 главных явления отказа изоляции РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ткани

Ухудшение РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и выпарки примесей в тканях, относительно ухудшения, позволили нам сперва посмотреть почему РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА извлекла от выращиванных в питательной среде: клеток легко не ухудшена. Существуя реагенты все извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ содержат компоненты которые быстро блокируют рНКазу. Добавьте lysate к выращиванным в питательной среде: клеткам, и просто смешайте его, все клетки можно тщательно смешать с lysate, и клетки совершенно лизированы. После того как клетки лизированы, активные ингредиенты в lysate немедленно блокируют внутриклеточную рНКазу, поэтому РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА остается неповрежденной. Что сказать, потому что выращиванные в питательной среде: клетки легко и полно контактированы с lysate, их РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА легко не ухудшена; с другой стороны, РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА в ткани легко ухудшена потому что клетки в ткани не легки быстро для того чтобы контактировать lysate. должный к достаточному контакту. Так, принимать там путь повернуть ткань в одиночную камеру пока блокируя деятельность при РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, проблема ухудшения смогла совершенно быть разрешена.

Филировать жидкого азота самые эффективные такой метод. Однако, метод жидкого азота филируя очень хлопотн, особенно когда число образцов большое. Это дало подъем следующей самой лучшей вещи: гомогенизатор. Метод гомогенизатора не рассматривает вопрос как деятельность при рНКазы заблокирована прежде чем клетки контактированы с lysate, но довольно молит что тариф нарушения ткани более быстр чем тариф на котором внутриклеточная рНКаза ухудшает RN.

Влияние электрического гомогенизатора лучшее, и влияние стеклянного гомогенизатора плохо, но вообще, метод гомогенизатора не может предотвратить явление ухудшения. Поэтому, если извлечение ухудшено, то первоначальный электрический гомогенизатор должен быть использован для молоть с жидким азотом; первоначальный стеклянный гомогенизатор должен быть изменен на электрический гомогенизатор или сразу филирован с жидким азотом. Проблема почти 100% возможное. получите разрешенной.

Проблема выпарки примеси влияя на последующие эксперименты имеет более разнообразные причины чем ухудшение, и решения соответственно другие. В заключение, если ухудшение или остаточные примеси в ткани, то метод/реагент извлечения для специфического экспириментально материала необходимо оптимизировать. Вы не должны использовать ваши драгоценные образцы для оптимизирования: вы можете купить некоторым небольшим животным как рыбы/цыпленок от рынка, принять соответствуя часть материала для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, и другую часть для извлечения протеина - молотилки с ртом, животом и выдержкой кишечников.

РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА цели извлеченной РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ использована для различных экспериментов по следования, и свои качественные требования другие

конструкция библиотеки cDNA требует целостности РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ без выпарок иов АБС битор реакции энзима; Северный требует более высокой целостности РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и понижает требования для выпарок иов АБС битор реакции энзима; RT-PCR не требует слишком высокой целостности РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, а блокирует реакции энзима. Требования к выпарки строги. Входной сигнал определяет выход; каждый раз цель получить РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ самой высокой очищенности, она будет стоить людей и деньги.

Собрание/хранение образцов

Факторы влияя на ухудшение после того как образец выйдет живущему body/or первоначальная окружающая среда роста, эндогенные энзимы в образце начнут ухудшать РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ, и тариф ухудшения связан с содержанием эндогенных энзимов и температуры. Традиционно, только 2 пути совершенно заблокировать эндогенную протеиновую активность: добавьте lysate немедленно и гомогенизируйте тщательно и быстро; отрежьте в небольшие части и немедленно замерзнуть в жидком азоте. Оба подхода требуют быстрой деятельности. Последнее соответствующее для всех образцов, пока бывшее только соответствующее для тканей с низким содержанием клеток и эндогенных энзимов и легче для того чтобы гомогенизировать. Специфически, ткань завода, печень, тимус, панкреас, хандра, мозг, сало, ткань мышцы, etc. наиболее хорошо замерзните с жидким азотом перед продолжением.

Фрагментация и гомогенизация образцов

Факторы влияя на фрагментацию образца ухудшения и выхода для тщательной гомогенизации, которая для полного и полного отпуска РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Клетки можно сразу гомогенизировать без быть сломанным. Ткани можно гомогенизировать только после быть сломанным. Дрожжам и бактерии нужно быть сломанным с соответствуя энзимами прежде чем их можно гомогенизировать. Ткани с более низким эндогенным содержанием энзима и более легкой гомогенизацией можно задавить и гомогенизировать в одно время в lysate гомогенизатором; ткань завода, печень, тимус, панкреас, хандра, мозг, сало, ткань мышцы и другие образцы, они также высоки в эндогенных энзимах или легко не гомогенизированы, поэтому нарушение и гомогенизацию ткани необходимо выполнить отдельно. Самый надежный и самый продуктивный метод фрагментации филирует с жидким азотом, и самый надежный метод гомогенизации польза электрического гомогенизатора. Особенное примечание о филировать с жидким азотом: образец необходимо растаять во время всего филируя процесса, по мере того как эндогенные энзимы более правоподобны для того чтобы действовать замерзанный.

Выбор lysate

Влияющ на удобство деятельности и факторы остаточных эндогенных примесей обыкновенно используемые решения лизиса могут почти заблокировать работу рНКазы. Поэтому, узловой пункт выбора решения лизиса рассматривать в комбинации с методом очищения. Одно исключение: порекомендованы, что используют образцы с высоким эндогенным содержанием энзима lysate содержа фенол для увеличения способности деактивировать эндогенные энзимы.

Выбор метода очищения

Факторы которые влияют на остаточные эндогенные примеси, скорость извлечения для чистых образцов как клетки, удовлетворительные результаты можно получить с почти любым методом очищения под рукой. Но для много других образцов, особенно тех с высокими уровнями примесей как заводы, печень, бактерии, etc., выбор соответствующего метода очищения критический. Метод очищения столбца центробежный имеет быструю скорость извлечения и может эффектно извлечь примеси которые влияют на последующую ферментационную реакцию РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, только его дорого стоит (Foregene может предложить рентабельные наборы, больше нажмите здесь деталей); использование экономических и классических методов очищения, как высыпание LiCl, может также получить удовлетворительные результаты, но время деятельности длинно.

«3 дисциплины и 8 вниманий» для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Дисциплина 1: Положите конец к загрязнению экзогенных энзимов.

Примечание 1: Строго несите маски и перчатки.

Примечание 2: Трубки центрифуги, головы подсказки, штанги пипетки, танки электрофореза, и экспириментально стенды, который включили в эксперимент должны тщательно быть размещаны.

Примечание 3: Реагенты/решения, который включили в эксперимент, особенно вода, должны быть свободны от РНКаз.

Дисциплина 2: Преградите работу эндогенных энзимов

Примечание 4: Выберите соотвествующий метод гомогенизации.

Примечание 5: Выберите соотвествующее lysate.

Примечание 6: Контролируйте начиная количество образца.

Дисциплина 3: Уточните вашу цель извлечения

Примечание 7: С любой системой lysate причаливая максимальному начиная количеству образца, показатель успеха извлечения падает остро.

Примечание 8: Единственный экономический критерий для успешного извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ успех в последующих экспериментах, не выход.

Источники 10 лучших загрязнения рНКазы

1. Пальцы первый источник экзогенных энзимов, поэтому перчатки необходимо носить и заменять часто. К тому же, маски необходимо также нести, потому что дышать также важный источник энзимов. Дополнительная выгода носить маску перчатки защитить экспериментатора.

2. Подсказки пипетки, трубки центрифуги, капают из пипетки – рНКаза не может быть деактивирована стерилизацией самостоятельно, поэтому подсказки пипетки и трубки центрифуги должны быть обработаны с DEPC, даже если они отмечено по мере того как DEPC обработало. Самое лучшее использовать одноцелевую пипетку, обтирает его с шариком хлопка алкоголя 75% перед использованием, особенно штанга; к тому же, быть уверен не использовать главного перевозчика.

3. Вода/буфер должны быть свободны загрязнения рНКазы.

4. По крайней мере таблица теста должна быть обтерта чистый с шариками хлопка алкоголя 75%.

• Эндогенная рНКаза все ткани содержат эндогенные энзимы, настолько быстрый замерзать тканей с жидким азотом самый лучший путь уменьшить ухудшение. Хранение жидкого азота/меля метод действительно неудобны, но единственный путь для тканей с высокими уровнями эндогенных энзимов.

6. РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА пробует продукты извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ может содержать трассировки загрязнения рНКазы.

7. Извлечение плазмиды извлечения плазмиды часто использует рНКазу для того чтобы ухудшить РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ, и остаточная рНКаза должна быть усвоена с протеиназой k и извлечена PCI.

8. Хранение даже если оно хранится на низкой температуре, ничтожные количества РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ рНКазы причинит ухудшение РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Самое лучшее решение для долгосрочной консервации РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ подвес соли/алкоголя, потому что алкоголь блокирует полностью ферментационную работу на низких температурах.

9. Когда катионы (Ca, Mg) будут содержать эти ионы, нагревать на 80C на 5 минут причинит РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ быть колоть, поэтому если РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЕ нужно быть нагретым, то решению консервации нужно содержать хелатируя агент (цитрат натрия 1mM, пэ-аш 6,4).

10. Энзимы используемые в последующих экспериментах могут быть загрязнены рНКазой.

10 подсказок для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1: Быстро предотвратить деятельность при рНКазы. Образцы быстро замерзаются после собрания, и рНКаза деактивирована быстрой деятельностью во время лизиса.

2: Выберите соотвествующий метод извлечения для ткани с высоким содержанием ribozyme, и жировая ткань самый лучший для использования метода содержа фенол.

3: Качество прогноза требует северного, конструкция библиотеки cDNA требует высокой целостности, и RT-PCR и RPA (assay предохранения от рибонуклеазы) не требуют высокой целостности. RT-PCR требует особой чистоты (выпарок иа АБС битор энзима).

4: Тщательная гомогенизация ключ к улучшать выход и уменьшению ухудшения.

5: Проверите целостность обнаружения электрофореза РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, 28S: 18S = 2: 1 полный знак, 1: 1 также приемлемо для большинств экспериментов.

6: Удаление ДНК для RT-PCR, анализ массива самое лучшее использовать Dnase i для того чтобы извлечь ДНК.

7: Уменьшите загрязнение экзогенных энзимов - энзимы нельзя импортировать от снаружи.

8: Концентрируя кислоту низко-концентрации нуклеиновую, реагент со-высыпания должен быть добавлен. Но предотвратить со-precipitant содержа энзимы и загрязнение ДНК.

9: Тщательно растворите РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ, при необходимости, жара на 65C на 5 минут.

соответствующий метод хранения

Оно можно хранить на – 20C на короткое время, и на – 80C в течение длительного времени. Первый шаг в улучшать выходы РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ осуществить что содержание РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ различных образцов меняет значительно. Высокое обилие (2-4ug/mg) как печень, панкреас, сердце, среднее обилие (0.05-2ug/mg) как мозг, зародыш, почка, легкий, тимус, завязь, низкое обилие (<0>

1: Лизируйте клетки для того чтобы выпустить RN – если РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА не выпущена, то выход будет уменьшен. Электрические работы гомогенизации лучшие чем другие методы гомогенизации, но могут также быть совмещенным с другими методами, как жидкий азот мять, ферментационное пищеварение (лизозим/Lyticase)

2: Оптимизирование метода извлечения. Самые большие проблемы с основанными на фенол методами неполная стратификация и частично потеря РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (супернатант нельзя совершенно извлечь). Неполная стратификация должна к высоким нуклеиновой кислоте и содержанию белка, которая могут быть разрешены путем увеличение используемого количества lysate или уменьшение количества образца. Шаг извлечения хлороформа был добавлен к жировой ткани. Потеря РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ может быть уменьшена путем назад-нагнетать или путем извлекать органический слой следовать центрифугированием. Самая большая проблема с методами столбца основанными на центрифугировани сверхнормальный образец.

Классические подсказки извлечения

1. Очищение фенола: Добавьте равный том фенола/хлороформа и смешивания 1:1 энергично на 1-2 минут. Центрифугуйте на высокой скорости на 2 минуты. Осторожно извлеките супернатант (80-90%). Никогда не получайте к среднему слою. Равный том решения реакции можно добавить к фенолу/хлороформу и супернатант извлек. 2 supernatants можно смешать совместно для нуклеинового кисловочного высыпания для того чтобы улучшить выход. Слишком не нежен смешивая, и не попробуйте извлечь полностью супернатант.

2. Стирка с этанолом 70-80%: Во время стирки, нуклеиновую кислоту необходимо приостанавливать для обеспечения что остаточное соль помыто прочь. В то же время, немедленно после лить с этанола, центрифуга на высокой скорости в течение нескольких секунд, и после этого извлекает остаточный этанол с пипеткой. Растворите после стоять на комнатной температуре на 5-10 минут.

11. Извлечение особенных организаций

1. Волокнистая ткань: Ключ к извлечению РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ от волокнистой ткани как сердце/скелетная мышца совершенно нарушить ткань. Эти ткани имеют низкую плотность клеток, поэтому количество РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ в вес блока ткани низко, и самое лучшее использовать как много начиная количества как возможный. Уверен смолоть ткань тщательно под замерзая условиями.

2. Ткани с высоко- протеином/жирным содержанием: содержание мозга/овоща жирное высоко. После извлечения PCI, супернатант содержит белые floccules. Супернатант необходимо реэкстрагировать с хлороформом.

3. Ткани с высоким нуклеиновой содержанием кислоты/ribozyme: хандра/тимус имеют высокое нуклеиновой содержание кислоты и ribozyme. Меля ткань под замерзая условиями следовать быстрой гомогенизацией может эффектно деактивировать ribozymes. Однако, если lysate слишком вязкостно (должный к высокому нуклеиновому кисловочному содержанию), то извлечение PCI не будет стратифицировать эффектно; добавление больше lysate может разрешить этот вопрос. Множественные извлечения PCI могут извлечь более остаточную ДНК. Если формы белые преципитата немедленно после добавления алкоголя, его показывают загрязнение ДНК. Реэкстракция с кислотным PCI после того как растворение сможет извлечь загрязнение ДНК.

4. Ткань завода: Ткань завода более сложна чем животная ткань. Вообще, заводы смолоты под условиями жидкого азота, так ухудшением РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ эндогенными энзимами неупотребительны. Если проблема ухудшения не разрешена, то она почти определенно причинена примесями, который содержат в образце. Примеси содержали в много заводов приведут к выпаркам, и причина для выпарок часто потому что эти примеси имеют некоторые сходства с РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ: вы осаждаете и я осаждаю, и вы адсорбируете и я адсорбирую. Эти характеристики определяют что они очень сильные иы АБС битор энзима.

В настоящее время, коммерчески реагенты извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ можно приспособиться к почти всем животным тканям с небольшими регулировками, но немногие коммерчески реагенты извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ которые могут быть соответствующие для большинств тканей завода. К счастью, Foregene может обеспечить особенные наборы извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ завода, мы имеет набор изоляции РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ завода полный, положительную величину набора изоляции РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ завода полную. Последнее специально конструировано для заводов с высоким содержанием полисахарида и полифенола. Для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, обратная связь от потребителей лаборатории особенно хороша.

12. Влияние образца замерзая и таяя замороженный образец может быть больше, и для этого нужно быть отрезанным перед быть использованным для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Образцы клонят расплавить (по возможности частично) во время вырезывания. Замерли образцы могут веситься перед извлечением РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, и таять определенно произойдет во время этого процесса. Иногда, таять образца также происходит во время процесса жидкого азота филируя; или замороженный образец сразу добавлен к lysate без жидкого азота филируя, и таять определенно произойдет перед полной гомогенизацией. Эксперименты показывали что замороженная ткань более прональна к ухудшению РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ во время таять чем свежая ткань. Правоподобная причина: Процесс замораживани-таяния нарушает структуры внутри клетка, делая его более легкой для эндогенных энзимов прийти в непосредственный контакт с РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ.

13. Суждение качества РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ обычно, электрофорез использовано для того чтобы судить целостность РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, и A260/A280 использовано для того чтобы судить очищенность РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. В теории, неповрежденная РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА имеет коэффициент 28S: 18S = 2.7:1, и большинств данные подчеркивают коэффициент 28S: 18S = 2: 1. Факт что почти никакая из РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ извлеченной от образцов за исключением клеток в коэффициенте 2:1 (это было получено используя Agilent Bioanalyzer).

Результаты электрофореза РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ повлияны на много факторов, включая вторичную структуру, условия электрофореза, нагрузка образца, степень насыщения EB, etc. используют родной электрофорез для того чтобы обнаружить РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ и использовать отметку ДНК как контроль. Если 28S на 2kb и 18S на 0.9kb ясны, и 28S:, то 18S > 1, целостность может соотвествовать большинств последующих экспериментов.

A260/A280 индикатор который причинял много запутанность. Прежде всего, необходимо уточнить первоначальный смысл этого индикатора для нуклеиновых кислот: чистая РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, своя A260/280 = около 2,0. Чистая РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА because и A260/A280 = 2 „влияние“. Теперь каждый использует A260/A280 как because, думая это «если A260/A280 = 2, то РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА чиста», которая естественно водит к запутанности.

Если вы заинтересованы, то вы можете добавить маленький реагент который часто использован в извлечении, как фенол, изотиоцианат гуанидина, КОЛЫШЕК, etc., к вашему образцу РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, и после этого измеряет коэффициент A260/A280. Реальность что много из реагентов используемых для извлечения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, так же, как много примесей в образце, поглощают вокруг A260 и A280, влияя на A260/A280.

Самый поучительный подход в настоящее время просмотреть образцы РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ в ряде 200-300 nm. Кривая чистой РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ имеет следующие характеристики: кривая ровна, A230 и A260 2 пункта инфлекции, A300 близко к 0, A260/A280 = около 2,0, и A260/A230 = около 2,0. Если данные по развертки не доступны, то коэффициент A260/A230 должен также быть решителен, по мере того как этот коэффициент более чувствителен к избытку всех примесей которые влияют на ферментационную реакцию. Учтите линейный пробег прибора (0.1-0.5 для A260).

2 других полезных явления: коэффициент будет около 0,3 более низким когда A260/A280 будет измерено в воде; пока коэффициент измерил в ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТЕ 10 mM около 0,2 более высокое чем это измеренное в ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАЦЕТАТЕ 1 mM.